Quantification de l'activité métabolique d'Ascaris suum L3 par réduction de la résazurine

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 243 (2023) Citer cet article

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Les infections helminthiques constituent un problème de santé publique important chez l’homme et ont un impact encore plus important sur le bien-être des animaux domestiques et du bétail. Les lectures actuelles pour les tests de dépistage de médicaments anthelminthiques sont le stade de développement, la migration ou la motilité qui peuvent être subjectives, laborieuses et à faible débit. Le but de cette étude était d'appliquer et d'optimiser une technique fluorométrique utilisant la résazurine pour évaluer les changements dans l'activité métabolique des larves de troisième stade (L3) d'Ascaris suum, un parasite de grande importance économique chez le porc.

Ascaris suum L3 ont été éclos mécaniquement à partir d'œufs embryonnés âgés de 6 à 8 semaines et enrichis en gradient de saccharose. Le colorant résazurine et A. suum L3 ont été titrés dans des plaques de microtitration à 96 puits et l'activité de réduction de la résazurine a été évaluée par fluorométrie après 24 h d'incubation. La microscopie à fluorescence a été utilisée pour localiser le site de réduction de la résazurine chez les larves. Enfin, nous avons exposé A. suum L3 à diverses conditions de stress, notamment la chaleur, le méthanol et les anthelminthiques, et étudié leur impact sur le métabolisme des larves par le biais de l'activité de réduction de la résazurine.

Nous montrons que la résazurine, un colorant non fluorescent, est réduite à l'intérieur du vital A. suum L3 en résorufine fluorescente et libérée dans le milieu de culture. Les paramètres de test optimaux sont de 100 à 1 000 L3 par puits, une concentration de résazurine de 7,5 µg/ml et une incubation à 37 °C/5 % de CO2 pendant 24 h. Une gaine L2 intacte autour de la L3 d'A. suum empêche complètement l'absorption de résazurine, tandis que dans la L3 non gainée, le signal de fluorescence le plus intense est observé le long de l'intestin moyen des larves. L3 exposé au méthanol ou à la chaleur présente une activité de réduction de la résazurine progressivement diminuée. De plus, une exposition de 24 heures à l'ivermectine à 0,625 µM, au mébendazole à 5 µM et au thiabendazole de 10 à 100 µM a diminué de manière significative l'activité métabolique des larves de 55 %, 73 % et 70 % à 89 %, respectivement.

Ensemble, nos résultats montrent que les facteurs de stress métaboliques et les médicaments anthelminthiques réduisent de manière significative et reproductible l'activité de réduction de la résazurine de A. suum L3, faisant du test proposé une méthode sensible et facile à utiliser pour évaluer l'activité métabolique de A. suum L3 in vitro. .

La lutte contre les nématodes gastro-intestinaux repose principalement sur la chimiothérapie chez l'homme et l'animal. Cependant, les traitements et réinfections récurrents, la limitation des classes de médicaments anthelminthiques actuellement disponibles [49], les rapports croissants faisant état d’une efficacité réduite des médicaments et l’évolution de la résistance aux anthelminthiques de première ligne tels que les benzimidazoles et l’ivermectine font prendre conscience de l’importance de la recherche sur les médicaments anthelminthiques [19, 22 , 30, 38]. La découverte rapide de nouveaux médicaments contre les géohelminthes (helminthes transmis par le sol) est principalement entravée par le manque de méthodes objectives de criblage à haut débit pour évaluer l'efficacité des médicaments (1, 20, 47).

L'évaluation microscopique de la motilité et de la morphologie domine les méthodes actuellement utilisées pour évaluer l'efficacité des médicaments chez les larves. Ces approches sont en général longues, laborieuses et sujettes à la subjectivité et ne conviennent donc pas au criblage à haut débit. Des dispositifs tels que le système xCELLigence [40] et le wMicroTracker System™ [24, 37] ont été validés pour le criblage de médicaments à haut débit avec Caenorhabditis elegans et quelques espèces d'helminthes parasites, mais la lecture est entièrement limitée à l'activité de locomotion. Par conséquent, des approches combinatoires qui abordent plusieurs paramètres lors de la sélection de nouveaux médicaments candidats sont discutées, comme une lecture générale comme l'activité de locomotion combinée avec une lecture spécifique pour le mode d'action putatif, comme l'activité électrophysiologique ou métabolique (12).

En plus de la motilité, la viabilité des nématodes peut être évaluée à l'aide de colorants indicateurs de l'activité métabolique qui sont convertis par les stades larvaires en un produit mesurable. Différents indicateurs métaboliques ont été testés pour les helminthes, tels que le colorant tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), le diacétate de fluorescéine (FDA), le phosphate de para-nitrophényle (pNPP). ) [34], et la résazurine, un colorant perméable aux cellules. La résazurine est basée sur la réduction de la résazurine en résorufine, dépendante du NADPH, et est largement utilisée pour surveiller la croissance cellulaire et le métabolisme cellulaire des mammifères dans un large éventail de cibles (23). Le test de réduction de la résazurine a été adapté jusqu'à présent pour le dépistage de médicaments chez les espèces adultes de Schistosoma [25, 26] et chez les larves de quatrième stade (L4) et les adultes Trichuris muris [39]. Au meilleur de nos connaissances, les données sur le potentiel du test de réduction de la résazurine chez Ascaris spp. Le parasite est absent, bien qu’il s’agisse de l’une des géohelminthiases les plus courantes dans le monde, tant chez l’homme que chez le porc [15, 17, 51].

95%. Of note, larvae inside eggs that we obtained from both the 23% and 25% sucrose layers appeared fully embryonated and were therefore pooled and used for all subsequent in vitro assays./p> 0.99). For larvae treated with 1.5 vol% methanol for 24 h, no significant impact on resazurin reduction activity was detected. However, gradual impairment of resazurin reduction activity was observed at concentrations of 3%, 6%, and 12%, resulting in significantly weaker fluorescence signals by 20% (P ≤ 0.05), 45% (P ≤ 0.0001), and 70% (P ≤ 0.0001), respectively. Methanol at 25% completely abrogated resazurin reduction. In the control, methanol itself at concentrations of 25% did not notably change fluorescence characteristics of resorufin (Additional file 2: Fig. S2). A gradual decrease in resorufin production was measured with increasing methanol concentrations. Four-parameter logistic regression revealed a half-maximal effective concentration (EC50) = 6.8% (df = 26, R2 = 0.95, 95% CI for EC50 = 4.3–9.2%) for methanol (Additional file 3: Fig. S3). Overall, for A. suum L3 exposed for increasing times to 60 °C or increasing methanol concentrations, we observed a gradually measurable decrease in resazurin reduction activity in the larvae./p>

1.14 mM in A. suum L4 (intestinal isolates 14 days post-infection). However, we were not able to reproduce an ivermectin concentration of 1.14 mM without precipitation of the drug in 0.5% DMSO. Therefore, we titrated ivermectin in 0.5% DMSO (in H2O) and detected turbidimetrically its maximum solubility at 1.56 µM in H2O (Additional file 4: Table S1). Moreover, the solubility of ivermectin in HBSS-AB was lower due to medium components like salts, sugar and antibiotics, which reduced the maximum soluble concentration to 625 nM. At this concentration of ivermectin, we observed 55% reduction in the activity of resazurin reduction in the L3, which consequently indicates a considerably lower EC50 value for A. suum L3 than for A. suum L4 observed by Hu et al. [16]. Hansen et al. [14] reported for ivermectin an IC50 of ~ 1 µM in A. suum L3, which is closer to our observations. However, for C. elegans, significant effects were observed at considerably lower ivermectin concentrations (0.6–20 nM ivermectin) [3, 12]. On the one hand, this may indicate that the resazurin reduction assay is less sensitive for detecting the effects of ivermectin on A. suum L3 compared to in vitro assays in other nematodes. On the other hand, together with the observations from Hu et al. [16] and Hansen et al. [14], it is conceivable that A. suum larvae are less susceptible to ivermectin than C. elegans larvae. The impact of thiabendazole and mebendazole on A. suum L3 have been investigated so far by Zhao et al. [50], who reported an EC50 values in the range of 2.3–150 nM using an agar migration assay for drug effect evaluation after 24 h drug treatment. However, 1000-fold higher concentrations of these anthelmintics resulted in significant but not complete inactivation of resazurin reduction activity by 73% to 89% in the present study. The direct comparison of the studies is difficult because the drug effects were evaluated using different methods. However, the resazurin reduction assay might be less sensitive in detecting impairments of larval locomotion rather than the agar migration assay but might provide a better sensitivity for detecting impairments of larval metabolic activity./p>

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